رفضه إنكار المسيح في أيام البابا يوأنس الرابع عشر البطريرك السادس والتسعين (1571- 1586م) حدث أن اقتنص أحد الحكام هذا الراهب خارج الدير، ولم يكتفِ بمنعه من العودة إلى البرية المقدسة، بل أراد إقحامه على إنكار المسيح له المجد. رفض الراهب رفضًا باتًا أن ينكر السيد المسيح، فصدر الحكم عليه بغرس السكاكين الحادة في يديه وإيقاد مشاعل على كتفيه، ووضعه على جمل يطوف به شوارع المدينة تحيط به الغوغاء الصاخبة، فتحَّمل هذا كله في صمت تام.

يبدو أن هدوءه زاد الحاكم غضبًا فأصدر أمره بربط يوحنا على عدد من الخشب وخلال ضربه وتعذيبه استودع روحه بين يديّ الآب السماوي، ونال الإكليل المعد للذين يصبرون إلى المنتهى، وكان استشهاد الراهب القديس يوحنا القليوبي يوم الأحد المبارك الموافق 30 هاتور سنة 1298ش (6/12/1582م). وفي اليوم التالي أنزلوا جثمانه الطاهر عن الخشبة، وسلموه للقبط الذين مضوا به إلى كنيسة الشهيدة بربارة بمصر القديمة، حيث أقاموا عليه الصلوات الكنسية ورفعوا الأسرار المقدسة، ثم دفنوه بتلك الكنيسة المقدسة مثوى الشهداء.